在基因疗法的开发与生产过程中，准确测定 AAV 基因组滴度对确保最终产品的有效性至关重要。传统上，这一任务主要通过 qPCR 以及近年来的数字 PCR（ddPCR）方法完成。两种方法各具优缺点。

qPCR 虽具备 4 个数量级的动态范围，但其缺点显著：变异系数（CV）可高达 30%，结果波动大；易受 PCR 抑制剂等干扰因素影响；外源 DNA 会产生负面干扰；分析耗时较长，且必须建立标准曲线。

ddPCR 则具有多项优势：无需标准曲线，准确性高，精密度在 3% 至 20% 之间。然而，这种优异的准确性与精密度仅在大约 2 个数量级的有限定量动态范围内可实现。ddPCR 的多重检测能力有助于分析基因组完整性，因而极具实用价值。但该方法检测流程长，操作步骤较为复杂，且同样受 PCR 技术局限性的影响，为常规应用带来挑战。值得注意的是，为使样本落入工作范围并减少工艺样本中的基质效应，通常需要将样本稀释 100 至 1,000,000 倍，这既引入了误差，也延长了样本处理时间。单样本检测成本也相对较高。

基于上述观察，我们开发了一种专为工艺样本设计的快速、简便且准确的检测方法，其核心优势在于精密度高、速度快、结果准确，尤其是操作简单。

我们的突破性方法融合了 DNA 杂交、免疫化学与生物膜干涉技术，流程简化为两步：在同一试管内完成裂解与杂交后，使用生物传感器进行检测。

该方法的核心是两条寡核苷酸探针：一条约 40 nt 的荧光素标记探针和一条 40 nt 的 SuPlex 探针。SuPlex 寡核苷酸包含一段 30 个胸腺嘧啶的序列，其 5′ 端和 3′ 端均标记有生物素。探针的靶区域可位于目标基因（GOI）或启动子/增强子区域内。裂解与杂交步骤包括在 95°C 加热后迅速冷却至 50°C。最终杂交样本使用抗荧光素生物传感器进行定量。

该检测方法的定量动态范围为 5E+9 至 5E+12，精密度在 3% 至 9% 之间，检测时间仅需 30 分钟。方法本身具有强稳健性，兼容 DNase1、蛋白酶 K、外源 DNA、PCR 抑制剂及工艺缓冲液，非常适用于研发与生产环节。尤为独特的是，该方法能够分别定量包装基因组的正链与负链。此外，我们使用针对 GFP、CMV 启动子、CMV 增强子和 SV40 区域的寡核苷酸探针获得的初步数据，显示了评估基因组完整性的潜力。

因此，虽然 qPCR 和 ddPCR 目前是 AAV 基因组滴度检测的主要工具，但本文所述的 DNA 杂交-生物膜干涉技术方法相较于 PCR 方法展现出显著优势。其能够通过提供链特异性滴度更深入地表征包装基因组内容物，并对多种抑制因子具有强耐受性，使其在研发与生产环境中均具有重要价值。进一步地，我们已将相同方法应用于慢病毒的直接 RNA 滴度检测，无需反转录步骤。