BLI 表征检查清单：满足 FDA 生物类似药 CAA 指南要求，并有望免除 III 期临床试验。

作者: Benjamin Osborn, PhD; Anuja Patil, MS; Indrani Chakraborty, PhD                                    

生物类似药监管迈入新时代

作为生物膜干涉技术（BLI）的发明者，Gator Bio 已与数十家正在推进生物类似药申报的客户开展合作。凭借丰富的实践经验，我们深入了解 FDA 所关注的多种分析方法，以及如何生成符合其要求的数据。本指南将介绍可比性分析评估（CAA）的整体流程，并重点介绍使 Gator Bio 成为您法规申报过程中可靠合作伙伴的技术创新。随着相关应用资料的发布，我们也将在此提供相应链接。

生物类似药是否仍然需要开展 III 期临床试验？

可能不需要。 FDA 于 2025 年 10 月发布的指南明确指出，当具备充分的可比性分析评估（CAA）时，无需开展比较性疗效研究。

FDA 于 2025 年 10 月发布的指南草案正式确立了其在生物类似药评价方面的重要转变：对于检测生物类似药与参比制剂之间是否存在具有临床意义的差异，严格的可比性分析评估（CAA）通常比比较性疗效研究具有更高的敏感性。对于符合特定条件、且已充分表征的生物制品而言，大规模比较性疗效试验已不再是默认要求。

这是一个重大变化。但要适用这一政策，产品仍需满足以下条件：

1. 来源于克隆细胞系

2. 高度纯化并完成全面表征

3. 具有明确的结构-活性关系，且相关质量属性可通过 CAA 检测方法进行评价

4. 已完成与参比制剂的人体药代动力学（PK）相似性研究和免疫原性研究

目前唯一仍不可替代的临床研究要求，是人体 PK 相似性研究和免疫原性评估。正如 FDA 指南所述，比较性疗效研究不再是必需项，但仍必须针对参比制剂完成 PK 相似性和免疫原性数据的获取。

2026 年 3 月发布的生物类似药指南有哪些变化？

2026 年 3 月发布的指南允许国际开发的生物类似药使用非美国上市的参比制剂替代美国参比制剂。

在 2025 年 10 月指南草案的基础上，FDA 于 2026 年 3 月正式发布了生物类似药问答指南（Q&A Guidance）第四次修订版。该指南允许在具有充分相似性数据支持的情况下，在临床研究中使用非美国上市的参比制剂替代美国批准的参比制剂。

此前，申办方若希望使用非美国参比制剂，必须开展完整的三方 PK 桥接研究，比较拟开发的生物类似药、美国参比制剂和非美国参比制剂，并要求三组两两比较均满足预先设定的相似性标准。根据新指南，只要国际版参比制剂具有充分的科学依据，并且 “整体证据能够支持生物类似性的证明”，则无需再进口美国版参比制剂用于比较药代动力学（PK）研究。

然而，要采用这一新路径（预计每个项目可节省高达 2,000 万美元的 PK 研究成本），前提是您的产品表征必须足够全面、严谨且可靠。

什么是 FDA 的可比性分析评估（CAA）？它应包含哪些内容？

可比性分析评估是用于证明生物类似药与参比制剂高度相似的完整分析证据体系。

至少应包括：一级结构，高级结构，子大小和电荷变体，靶抗原结合动力学，完整的 Fc 受体分析，基于细胞的功能检测，糖链分析。

其中，BLI 是上述多个关键检测项目的主要分析方法之一。

BLI 在可比性分析评估（CAA）中具体承担哪些作用？

针对单克隆抗体（mAb）生物类似药的 CAA，一套完整的 BLI 分析通常包括 7 项结合测定：靶抗原亲和力/结合动力学、FcRn 结合与释放、完整的激活型和抑制型 Fcγ 受体分析、C1q 补体激活，以及表位确认。

下表总结了完整的 BLI 检测项目，包括各项实验推荐的捕获方式及相应参考文献。

Gator BLI 已被美国药典（USP）多个章节列为生物类似药表征方法，包括<1105>（免疫学检测方法，涵盖表面等离子共振及相关光学生物传感器方法）、<1106>（免疫原性检测）和<1108>（Fc 介导效应功能评价方法）。被纳入 USP 表明，该方法具有良好的可靠性、重复性和适用于动力学测定的能力，因此成为靶抗原结合分析和完整 Fc 受体分析的主要技术之一。此外，Gator BLI 兼具高通量和高灵敏度，非常适合生物类似药表征所需的多批次比较研究。

Gator Bio 还提供了多种开箱即用的捕获方案，使上述实验更加便捷。其中，HIS XT 为 Fc 受体研究提供了简单易用的解决方案，而 Anti-FAB 生物传感器则适用于 FcRn 表征。这意味着，Gator BLI 不仅是药物发现阶段的重要工具，也是 CAA 过程中不可或缺的关键分析平台。

为什么 FcRn 结合对生物类似药获批至关重要？如何进行测定？

FcRn 检测结果能够预测抗体在体内的血清半衰期——如果生物类似药与参比制剂的 FcRn 结合动力学不同，其血清半衰期也会有所不同。

与大多数蛋白相比，抗体在血液循环中的半衰期明显更长。这种较长的半衰期主要归因于 FcRn（新生儿 Fc 受体），该受体表达于巨噬细胞和内皮细胞的内体（endosome）中。当抗体被这些细胞内吞并运输至溶酶体时，FcRn 会在内体的酸性环境（约 pH 6.2）下与抗体 Fc 区结合，使抗体避免被降解，并将其重新循环回到血液中。在生理 pH（7.4）条件下，FcRn 与抗体解离，完成整个回收循环。因此，对这种 pH 依赖性的结合过程进行生物物理表征，可以从机制上预测抗体的血清半衰期。

已有研究表明，BLI 能够可靠且可重复地测定 FcRn 相互作用^[2]。此外，与用于 FcRn 检测的微球法相比，BLI 受蛋白聚集体干扰的风险更低^[3,9]。另外，BLI 已被证明具有检测 Met252 和 Met428 氧化的灵敏度，因此也是一种具有成本优势的制剂评价方法。

使用 BLI 开展 FcRn 研究时的几点建议：

• 在实验过程中体现 pH 的变化。 在低 pH（6.2）条件下测定结合和解离过程，然后切换至较高 pH（7.4），观察解离行为的变化^[2][3][9]。

• 采用能够保持 Fc 区暴露的捕获方式。 建议使用 Protein L 捕获抗体轻链，或使用链霉亲和素捕获生物素化抗体，以保证 FcRn 能够与 Fc 区结合。（不推荐使用 Anti-Fab 捕获，因为捕获分子本身含有 Fc 结构域。）

  
  

Fcγ 受体结合数据如何证明生物类似性？

Fcγ 受体结合动力学是表征生物类似药效应功能特征的重要组成部分。如果与参比制剂存在差异，则可能影响其临床活性。

生物类似药中糖链的差异会影响 Fc 受体功能，并对效应功能产生实际影响^[10]。例如，岩藻糖基化会影响 FcγRIIIa 的结合（该受体参与 ADCC/NK 细胞介导的效应功能）^[11]；而半乳糖基化主要影响 FcγRIIa 介导的 ADCP/吞噬作用（同时也可能影响 FcγRIIIa）^[12,13]。

BLI 非常适合表征这些差异，它能够直接测定 Fc 受体结合动力学，既可作为质谱糖链分析的补充，又能避免微球法中常见的实验伪影^[5]。

使用 BLI 开展 Fc 受体研究的几点建议：

• 提高快速结合/快速解离受体（如 CD32a/FcγRIIa）的数据采集质量。 将数据采集频率设置为      10 Hz，振荡速度降低至 400 RPM，并尽可能将样品板温度控制在 25°C 或以下（如 Gator Pivot）。

• 控制加载量至关重要。 生物传感器过度加载会导致异常且难以分析的动力学曲线。例如，使用 HIS XT 生物传感器时，建议将 CD32a/FcγRIIa 的加载信号控制在 0.5 nm 以下（低于最大容量的 10%），以获得抗体结合阶段平坦的平台曲线。

• 高浓度抗体实验时，应封闭生物传感器或采用双重参比校正。当抗体浓度高于 2 μM 时，许多抗体会与生物传感器组分发生非特异性相互作用。

• 参比制剂和生物类似药应使用同一批生物传感器。      这样可以避免生物传感器加载密度的差异，并建议连续测试两者，以减少不同实验日期带来的变化。

• 加入正交糖工程对照。 例如，可使用去岩藻糖化 IgG 作为 FcγRIIIa 结合的阳性对照，在正式实验前确认 Fc 受体活性。

• 选择不含 Fc 捕获化学的生物传感器。 常见的问题来源是传统 Anti-His 生物传感器，其使用兔源或鼠源抗体捕获 His 标签 Fc 受体。Gator HIS XT 采用 AI 设计的 NovoBody™，不含 Fc 结构域（详情请参阅相关介绍）。其他不含 Fc 捕获化学的生物传感器还包括 Strep-Tactin XT、Streptavidin 和 Ni-NTA。

图示： 实验室测定的 FcγRIIa/CD32a（R167） 与抗体的相互作用。按照上述建议，首先使用 HIS XT 生物传感器将 CD32a 加载至 0.5 nm，随后加入浓度范围为 2500–78 nM 的抗体。测得结果为：K_D = 9.62 × 10⁻⁷，k_on = 1.26 × 10⁵，k_off = 1.21 × 10⁻¹，与文献报道结果一致。

对于糖基化的直接检测，Gator BLI 的检测结果与 FPLC 测定的高糖基化样品唾液酸化结果呈线性相关。该方法详见相应的应用说明，在开发高度工程化参比制剂的生物类似药时具有重要参考价值。

什么是 C1q 检测？为什么它很重要？

C1q 检测用于预测免疫系统的激活能力。

补体依赖性细胞毒作用（CDC） 是 IgG 治疗性抗体介导靶细胞杀伤的重要效应机制之一。这一过程始于抗体与 C1q 的结合，该结合会触发一系列蛋白水解级联反应，最终形成膜攻击复合物（MAC），导致靶细胞裂解。在生物类似药的验证过程中，C1q 相互作用活性是证明目标抗体效力和生物活性的关键指标，用于证明生物类似药具有与参比制剂相当的 CDC 激活能力。

使用 BLI 开展 C1q 研究的几点建议：

1. 通过抗体轻链将抗体固定到生物传感器表面。这样可以保证整个 Fc 区域充分暴露，便于 C1q 与其结合。最常用的生物传感器是 Protein L。另外，如果抗体-抗原相互作用解离较慢，也可以通过抗原固定抗体。用于抗原捕获的 HIS XT、Strep-Tactin XT、Streptavidin 和 Ni-NTA 生物传感器均可用于此类实验。

注意： 应选择不含 Fc 结构域的生物传感器。不推荐使用 Anti-FAB 生物传感器。同样，也不建议将抗体通过胺偶联方式固定到 Amine Reactive（AR）生物传感器上，因为这可能降低 C1q 的结合活性。

2. 控制合适的加载密度：C1q 是一种多聚体，其结合依赖于亲合效应（avidity）。在 Protein L（ProL）生物传感器上，将抗体加载至 2–4 nm，通常可以获得稳定一致的 C1q 相互作用结果。

图示： 实验室采用 ProL 生物传感器（加载量 2 nm）测定 Cetuximab 与 C1q（Abcam） 的相互作用。测得动力学参数为：K_D：5.56 × 10⁻⁹，k_on：3.56 × 10⁶，k_off：1.98 × 10⁻²，所得结果与文献报道一致。

什么是表位分组？为什么 FDA 希望在生物类似药的 CAA 中看到这项分析？

表位分组用于确认生物类似药与参比制剂是否结合靶抗原上的同一表位（结合位点）。

许多治疗性抗体不仅能够激活针对靶标的免疫反应，还会改变靶标的构象，并调节其生物学活性。因此，生物类似药不仅需要在靶标结合亲和力方面与参比制剂保持一致，还需要结合相同的表位，才能更好地模拟参比制剂的作用机制。

Gator BLI 支持采用夹心法或串联法开展大规模表位分组实验，并提供多种开箱即用的捕获方案。Gator 仪器针对表位分箱工作流程进行了优化。例如，Gator Pro 32 通道系统配备 4 个微孔板位，可在一次实验中完成 32 × 32 的表位分组分析。即使是 8 通道仪器，也能够开展高通量表位分组实验。例如，Gator Plus 支持最高 16 × 16 的表位分组格式，为初创生物类似药研发实验室提供高通量分析能力。点击此处了解如何使用 Gator 仪器开展表位分组实验。

21 CFR Part 11 合规性在生物类似药生物制品许可申请（BLA）的 BLI 数据中有何作用？

数据完整性并不是在项目结束时才需要勾选完成的一项要求。

21 CFR Part 11 规定了 FDA 对电子记录和电子签名的要求。仪器生成的数据、方法文件以及分析结果都需要具备用户身份认证和完整的审计追踪，以记录谁在何时执行了哪些操作。

Gator Bio 仪器提供可选的 Part 11 合规软件包，能够限制实验方案的修改、根据用户角色控制访问权限，并确保数据无法在采集后进行修改。这使您的数据从采集完成的那一刻起，就具备了用于法规申报的条件。

为即将到来的“专利悬崖”做好准备

专利悬崖已经到来，并且正在加速。据预测，到 2030 年，将有超过 2,000 亿美元的生物制品销售额因专利到期而失去市场独占权。而 FDA 于 2025 年 10 月和 2026 年 3 月发布的最新指南，已经消除了生物类似药开发过程中两项最大的成本障碍。

对于从项目启动阶段就重视严格分析表征的研发项目而言，如今的生物类似药获批路径比以往任何时候都更加快捷、经济。

Gator Bio 仪器可完成整个基于 BLI 的 CAA 分析体系，包括：抗原结合动力学，FcRn 结合与释放，完整的 Fcγ 受体分析，C1q 检测，表位确认。 该平台具有以下特点：32 个通道均采用独立光谱仪，保证数据质量一致； 提供 Fc 受体实验所需的温度控制；HIS XT 生物传感器可消除 Fc 背景干扰； 提供可选的 21 CFR Part 11 合规软件包，确保数据完整性，满足法规申报要求。

如果您正在建立 CAA 分析体系，并希望与生物类似药表征专家共同探讨实验方案，欢迎联系我们。

参考文献

[1]   U.S. Department of Health and Human Services, “New and Revised Draft Q&As on Biosimilar Development and the BPCI Act (Revision 4) Guidance for Industry,” 9 March 2026. [Online]. Available: https://www.fda.gov/media/119278/download.

[2]   S. Ko, M. Jo, M. Kyung, W. Lee, W. H. Ko, J.-H. Na, Y. S. Chun, B. J. Ko and S. t. Jung, “Engineering FcRn binding kinetics dramatically extends antibody serum half-life and enhances therapeutic potential,” Journal of Biological Engineering, vol. 19, 2025.

[3]   A. Bajardi-Taccioli, A. Blum, C. Xu, Z. Sosic, S. Bergelson and M. Feschenko, “Effect of protein aggregates on characterization of FcRn binding of Fc-fusion therapeutics,” Molecular Immunology, vol. 67, no. 2, pp. 616-624, 2015.

[4]   K. P. Geuijen, C. Oppers-Tiemissen, D. F. Egging, P. J. Simons, L. Boon, R. B. Shasfoort and M. H. Eppink, “Rapid screening of IgG quality attributes – effects on Fc receptor binding,” FEBS Open Bio, vol. 7, no. 10, pp. 1557-1574, 2017.

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[7]   A. Chouquet, A. J. P, J. Hennicke, w. L. Ling, I. Bally, L. T. N. Schwagerlehner, R. Kunert and J.-B. Reiser, “Biophysical Characterization of the Oligomeric States of Recombinant Immunoglobulins Type-M and Their C1q-Binding Kinetics by Biolayer Interferometry,” Front Bioeng Biotechnol., vol. 10, 2022.

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[14] N. Nepur, S. Joshi, D. Guillarme and A. S. Rathore, “Analytical Similarity Assesment of Biosimilars: Global Regulatory Landscape, Recent studies and Major Advancements in Orthogonal Platforms,” Front. Bioeng. Biotechnol., vol. 10, no. 832059, 2022.